淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術 液氮罐

　　1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。

　　制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

　　一、細胞融合前準備

　　(一)　免疫方案

　　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定。

　　1.　顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:

　　初次免疫　　　　　　　1×107/0.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)

　　↓　2～3周后

　　第二次免疫　　　　　　1×107/0.5ml ip

　　↓　3周后

　　加強免疫(融合前三天)　1×107/0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐劑皮下多點注射

　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml/點)

　　↓3周后

　　第二次免疫　劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip

　　│　　　　　　　(ip劑量不宜超過0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫　劑量同上，不加佐劑，ip

　　│ (5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。液氮罐

　　(二)　飼養(yǎng)細胞

　　在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。

　　小鼠腹腔巨噬細胞的制備

　　小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周齡

　　↓

　　拉頸處死　浸泡于75%酒精，消毒3～5分鐘

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液

　　↓

　　反復沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　放入10ml離心管，1200轉/分離心5～6分鐘

　　↓

　　用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調整細胞數(shù)1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37℃　CO2孵箱培養(yǎng)

　　一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5×106/ml，小鼠脾細胞為1×106/ml，小鼠的成纖維細胞(3T3)1×105/ml，均為100μl/孔。

　　(三)　骨髓瘤細胞

　　骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量　McAb。

　　常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。

　　骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20%，細胞的**密度不得超106/ml，一般擴大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。

　　一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。

　　保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95%，也是決定細胞融合的關鍵。

　　(四)　免疫脾細胞

　　免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。

　　脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細胞數(shù)為2×108左右。液氮罐

　　二、細胞融合，選擇雜交瘤

　　(一)　細胞融合流程

　　(1)　取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP2/0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

　　(2)　同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

　　(3)　將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。

　　(4)　棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。

　　(5)　輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。

　　(6)　在室溫下融合:

　?、佟?0秒內(nèi)加入預熱的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO，邊加邊攪拌。

　?、凇∽饔?0秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。

　?、邸〖宇A熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　(7)　離心，800rpm，6分鐘。

　　(8)　棄上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。

　　(9)　根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。

　　(10) 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

　　一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。

　　(二)　HAT選擇雜交瘤

　　應用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。

　　一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20%小牛血清完全培養(yǎng)液中。

　　因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200μl/孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的2/3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。

　　50×HAT

　　H:　5×10-3M

　　A:　2×10-5M

　　T:　8×10-4M

　　一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。

　　三、抗體的檢測

　　篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。

　　檢測抗體的方法應根據(jù)抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原(蛋白質)、細胞和病毒等McAb的檢測。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。

　　3.　FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。

　　4.　IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

　　上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

　　可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

　　四、雜交瘤的克隆化和凍存

　　克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞;所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　(一)　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

　　1.　有限稀釋法的程序

　?、佟≈苽滹曫B(yǎng)細胞懸液(同融合前準備)

　　②　陽性孔細胞的計數(shù)，并調細胞數(shù)在1～5×103/ml

　?、邸∪?30個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個/ml，100μl/孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml 含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個/ml，100μl/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。

　?、堋∨囵B(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200μl/孔。

　?、荨〉?～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。

　　注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。

　　2.　軟瓊脂法

　　①　軟瓊脂的配制

　　含20%FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640

　　1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　?、凇∮蒙鲜?.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　　③　按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　　④　1ml 0.5%瓊脂液(42℃預熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　?、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5%CO2孵箱中。

　?、蕖?～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。

　?、摺z測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再克隆化。

　　(二)　雜交瘤細胞的凍存

　　及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

　　細胞凍存液:

　　50%小牛血清

　　40%不完全培養(yǎng)液

　　10%　DMSO(二甲亞砜)

　　凍存液**預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中?；蚣毎芙抵?0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

　　五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg/ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。

　　2.　體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　　①　實體瘤法　對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg/ml。但采血量有限。

　?、凇「顾闹苽洹〕Ｒ?guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

　　六、單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定:

　　1.　抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如① 制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②　制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2.　McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG(3%)，將有利于沉淀線的形成。

　　3.　McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4.　McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5.　McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。

　　七、影響因素、失敗原因分析

　　由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有:

　　1.　污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

　　2.　融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

　　3.　雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　?、佟∪诤虾笥屑毎L，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。

　?、凇∮锌赡苁敲庖咴乖匀?，免疫效果不好。

　　③　對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

　　要應用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。

　　要定期進行再克隆。

　　三不要:

　　不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

　　不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

　　不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

　　4.　雜交瘤細胞難以克隆化 液氮罐

　　可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養(yǎng)液加HT。